狗狗如何做细小检测？
犬细小病毒病（Canine parvovirus disease，CPV）是由CPV病毒感染幼犬引起的以急性出血性肠炎和心肌炎为特征的烈性传染病[1] 。该病具有极高的传染性和病死率[2-3] ，是危害宠物饲养业发展的重要疾病之一。目前临床上治疗CPV的主要措施包括隔离患犬、对症支持治疗和免疫接种等，但尚无理想的治疗药物或手段能根治本病[4-6] ；因此，研究有效的预防措施对于防治CPV具有重要意义。
目前，临床上常用的CPV疫苗有细胞培养苗及弱毒活疫苗两大类 [7，8] ，前者包括鸭胚疫苗、鸡胚疫苗、兔肾细胞疫苗(RK13) 和组织培养细胞基质疫苗(MA-PCC) 等，后者主要包括多联疫苗和二联疫苗两类。尽管现有的CPV疫苗可以刺激机体产生保护性抗体，预防CPV感染，但其免疫效果尚不理想，且存在一定的副作用[5，9] 。因此，有必要开发新型的安全高效的疫苗用于预防和控制CPV。
基因工程亚单位疫苗是由病原微生物的保护抗原经基因重组技术获得的重组蛋白疫苗。相对于灭活疫苗而言，该疫苗不仅可避免使用灭活剂处理过程中带来的副反应，而且由于不需要将病原体长期存放在冰箱中保存，从而减少了病原菌发生生物变异的风险。另外，其生产工艺相对简单，生产成本相对较低，易于规模化生产[10，11] 。因此， 基因工程亚单位疫苗具有广阔的应用前景。 目前，已经成功研发的CPV基因工程亚单位疫苗包括CPV 2a株L1~L3蛋白疫苗[12～14] 、CPV 2c 株L1~L3蛋白疫苗[8] 以及CPV-2a 株核心蛋白疫苗[15，16] 等。这些疫苗的研制不仅丰富了CPV疫苗的种类，也为研发安全高效的新一代CPV疫苗奠定了良好的基础。
基于以上背景，我们采用原核表达系统表达了含有B 糖衣膜蛋白及L 核衣壳蛋白的两个CPV主要结构蛋白，并进一步纯化了所获得的表达产物，为进一步制备基因工程亚单位灭活疫苗奠定了基础。
结果与分析 CPV B 糖衣膜蛋白在含有4 mM MgCl 2 的TB 肉汤中进行诱导表达时，SDS PAGE 和Western Blotting 检测结果表明，表达产物主要以包涵体形式存在，少量蛋白以可溶形式分布于培养液中。当诱导温度降低至28℃时，表达产物的可溶性明显增加，并且基本无包涵体存在(图1A 和 D) 。为了去除诱导产物中非特异性蛋白带，我们将获得的可溶性表达蛋白进行亲和层析纯化后得到了较纯的表达产物，SDS PAGE凝胶电泳结果显示，纯化的表达产物基本上均为一约70 ku大小的条带(图1E 和 F)。我们还对纯化的表达产物进行了Western Blotting鉴定。如图1G 和 H所示，表达产物与CPV阳性血清能够发生特异性反应，而与其它动物病毒性肠炎病毒的阳性血清无明显反应，表明获得了较纯的CPV B 糖衣膜蛋白。同时，纯化的表达产物也具有良好的抗原特性。
CPV L 核衣壳蛋白质SDS PAGE凝胶电泳结果显示，诱导产物也以包涵体质粒的形式表达(图2A ) 。在含有4mM MgC l 2 的TB 肉汤中诱导表达的产物主要以包涵体质粒的形式表达，而在不含MgC l 2 的TB 肉液中诱导表达的产物则出现了较多的可溶性蛋白带(图2B ~ E )。纯化后的表达产物基本上呈一条约30 ku左右的条带(图2F). Western blotting结果同样显示，纯化后的表达产物与CPV阳性血清发生了特异性反应而与其他动物的病毒性肠炎阳性血清无明显反应(图2G) ，这表明得到的纯化的CPV L 核衣壳蛋白也具有良好的抗原特性。 为考察CPV B 糖衣膜蛋白及CPV L 核衣壳蛋白作为基因工程亚单位疫苗的免疫保护潜力，我门构建了包含有B 糖衣膜蛋白和L 核衣壳蛋白基因的克隆载体pET-B/L ，并将其转化到大肠杆菌BL 21(DE 3)(图3A 和 C) . 然后利用IPTG 对B 糖衣膜蛋白和L 核酸衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的体外表达进行了诱导试验。实验结果表明，CPV B 糖衣膜蛋白及L 核酸衣壳蛋白可在细菌中获得较高水平的表达，分别为细菌可溶性蛋白总量的10%左右和1%~3%(图3D ， E ， G，H)， 但两者均以包涵体的形式存在。这主要是由于包涵体作为一种理想的表达重组蛋白的形式可以减少分泌途径造成的污染，提高目的蛋白的产量。
为了评价所获得的表达产物的免疫原型能否刺激机体产生保护力应答，我们以CPV为阳性抗原，分别制备了B 单克隆抗体及L 多克隆抗体并用ELISA方法测定了抗体的效价。结果表明，ELISA检测结果均呈现明显的“阳—阳”型反应曲线 (图4C 和 D) ， 说明这两株单抗具有较高的亲和力并能很好地与各自的中和抗体相对应，即二者均是高效的抗体分子。
讨论 本研究应用毕赤酵母表达体系对B 糖衣膜蛋白及L 核酸依壳蛋白进行了成功的高效诱导表达，并对